BIOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

• RECUENTO ESTÁNDAR DE COLIFORMES TOTALES

El grupo de microorganismos denominados coliformes corresponden a bacterias Gram negativas de morfología cocobacilar, oxidasa negativa, que se encuentran en el intestino humano y de animales. Son utilizadas como indicadores de contaminación, por ser habitantes normales del intestino del hombre y animales de sangre caliente.
Al crecer en medios de cultivo tipo ENDO, las bacterias coliformes metabolizan la lactosa con la producción de aldehído y ácido, el aldehído libera la fuschina del compuesto fuschina-sulfito. La fuschina luego colorea las colonias de rojo en algunos casos esta reacción es tan intensa que se el color rojo viene acompañado de un brillo metálico. Este procedimiento aplica para todo tipo de aguas.

Objetivo
Describir el procedimiento para el recuento de coliformes totales en muestras de agua, por el método de filtración por membrana y empleando medios de cultivo tipo ENDO.

Equipos, Materiales y Reactivos
Frascos en borosilicato para la preparación de medios de cultivo, con tapa rosca resistente a la esterilización, Cajas de Petri desechables estériles, en material plástico, de aproximadamente 50-60 y 90 mm de diámetro, Membranas de filtración  estériles, de 47 mm de diámetro y poro de 0.45 mm, Horno microondas, Autoclave, Cabina de flujo laminar, Equipo de filtración, Incubadora a temperatura de 35 ± 1°C, Contador de colônias, Baño María a temperatura de 44.5 ± 0.5°C, Tubos Durham, Gradillas resistentes a la esterilización, Tubos de ensayo con tapa rosca, Agua estéril para dilución o lavado: destilada o peptonada al  0.1%, Agar ENDO-LES para filtración por membrana: Una vez preparado, sirva de 4 a 6 mL en las cajas de Petri,  Etanol al 96%, Caldo bilis verde brillante al 2%, La preparación de los medios de cultivo, siga las instrucciones del fabricante.

Procedimiento
Para la recolección de muestras se utilizan frascos de vidrio o plástico, tapa rosca o esmerilada. Las condiciones ambientales de temperatura y humedad, no son críticas para la realización de este ensayo. la dilución (de ser necesaria)  y la siembra de la muestra, deben realizarse en la cabina de flujo laminar.

Selección del  volumen de muestra a filtrar
Según la naturaleza de la muestra, seleccione el volumen a filtrar, y de ser necesario, haga diluciones adecuadas. Un volumen ideal de muestra es aquel que produce entre 20 y 80 coliformes y no más de 200 colonias de todos los tipos. Los volúmenes sugeridos se indican en la Tabla # 1.

TABLA # 1. Volúmenes de muestra sugeridos para la prueba de filtración por membrana para coliformes totales.

Tipo de agua	volúmenes (mL)
	100	50	10	1	0.1	0.01	0.001	0.0001
Agua potable	X
Piscinas	X
Pozos, fuentes	X	X	X
Lagos, reservorios	X	X	X
Suministro de agua cruda			X	X	X
Agua de playa (baño)			X	X	X
Agua de río				X	X	X	X
Agua residual clorada				X	X	X
Agua residual					X	X	X	X

 
Para diluciones inferiores a 0.1 mL, utilice factores de 10n, donde n = 1, 2, 3...etc.

Filtración de la muestra
Inicialmente y sin destapar el frasco de la muestra, ésta debe homogeneizarse mediante agitación manual. Cuando se filtre menos de 50 mL de muestra, agregue 10 mL o más de agua de dilución al embudo antes de adicionar la muestra, con el propósito de conseguir una distribución homogénea de las bacterias sobre el filtro de membrana. Una vez terminada la filtración de la muestra, enjuague el embudo adicionando de 20 a 30 mL de agua de dilución. Posteriormente, retire los embudos y coloque el filtro de membrana sobre  el medio de cultivo. Evite la formación de burbujas o de arrugas en el filtro.

Incubación
Las cajas de Petri se incuban en posición invertida a una temperatura de 35 ± 1°C por un tiempo máximo de 24 horas aunque puede producirse el brillo característico desde las 16 horas.

Conteo de colonias
Las colonias típicas de coliformes tienen un color rosa a rojo con un brillo metálico característico, el cual puede cubrir toda la colonia, la parte central o la periferia. Se deben contar las colonias típicas y atípicas, estas últimas pueden ser rojas oscuras, mucoides, blancas o nucleadas sin brillo metálico.

Prueba de Confirmación
Ocasionalmente colonias típicas con brillo metálico pueden ser producidos por microorganismos no coliformes y las colonias atípicas (rojas obscuras o colonias sin brillo) pueden ser coliformes. Preferiblemente confirme tanto las colonias típicas como las atípicas.

El número de colonias a confirmar se hará de acuerdo a los siguientes criterios:
Para conteos menores de 5 colonias, confirme todas; para conteos entre 5-50 colonias, confirme por lo menos 5 colonias; para conteos entre 50-100 colonias, confirme el 10%, y para recuentos mayores de 100, confirme 10 colonias.

Para la confirmación se emplea la prueba de fermentación de la lactosa:
Repique con asa estéril, cada una de las colonias seleccionadas en un tubo con caldo verde bilis brillante con tubo de Durham e incúbelo por 48 horas a 35 ± 1°C. Una vez terminado el tiempo de incubación, si hay turbiedad y formación de gas, la prueba es positiva.

Cálculos y presentación de resultados
La siguiente ecuación permitirá el cálculo de las colonias una vez hayan sido confirmadas como coliformes totales:

Donde,

RF = Recuento final
CT = Conteo total de colonias de coliformes totales
CC = Número de colonias confirmadas
CP = Número de colonias positivas
 V  = Volumen sembrado (en mL)

Como regla general, aproxime al número entero inmediatamente superior, cuando el decimal es mayor e igual a 0.5. Por otro lado, mantenga el entero que precede al decimal, cuando este último es menor  0.5.  Realice estas aproximaciones en los resultados finales.

El conteo ideal se realiza en las cajas que tengan entre 20 y 80 colonias de coliformes y no haya  más de 200 de todos los tipos. Si hay más de una caja con recuentos dentro de este rango, informe el promedio. De no haber cajas en el rango ideal, considérelas todas, incluidas aquellas sin crecimiento.

Si no hay presencia de coliformes al filtrar 100 mL de muestra, técnicamente se debería informar como < 1 Coliforme/100 mL. Sin embargo, para propósitos prácticos y evitar confusiones, en los informes emitidos para personal no especializado, informe como 0 coliformes/100 mL de muestra.

Si se presenta un crecimiento que cubra la totalidad o parte del área de filtración y no se observa claramente separación entre colonias, tomar del filtro una muestra representativa para su confirmación. En función del resultado, se informará: si es positivo, reportar como “crecimiento confluente con coliformes totales”; de ser negativo, reportar como “crecimiento confluente con colonias sugestivas de coliformes totales”. En este último caso, se sugiere repetir la muestra con el fin de confirmar el resultado.

Si el crecimiento de colonias supera las 200 colonias se reportará como: “Muy numerosas para ser contadas” (MNPC).

Para informes técnicos requeridos en detalle, y en el caso de que se haya procesado menos de 100 mL de muestra y ésta hubiese dado como resultado cero (0) Coliformes totales, informe el resultado como 0 UFC sobre la cantidad de mL de muestra procesada, -ej. 0 UFC/10 mL.

Cuando a la misma muestra se realiza también el análisis de coliformes fecales y el resultado de estos resultara mayor que el de totales, debe informarse el resultado de fecales como si fuera totales.

Para expresar el resultado final y con el fin de evitar confusiones, cuando el valor es hasta de 3 dígitos, repórtelo como se obtuvo; para resultados superiores, expréselo en notación científica usando dos cifras significativas. Este resultado se informa como UFC/100 mL.

Bibliografía

• APHA-AWWA-WEF (2005) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 210th Edition. New York, 9-60 a 9-65, método 9222 B.
• KONEMAN ELMER,  Washington C. Winn,  Stephen D. Allen, William M. Janda, Gary W. Procop, Paul C. Schrenckenberger, Gail L. Woods (2008) Diagnostico Microbiológico, Texto y Atlas a color. Sexta edición, Editorial Panamericana.
• MERCK (200?) Microbiology Manual 12th Edition, Darmstadt, pág. 338.
• OXOID (1998) Manual 8th Edition, Hampshire, pág. 2-56.