BIOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

• RECUENTO DE ENTEROCOCOS

El subgrupo Enterococos hace parte de los Estreptococos fecales, los cuales están conformados por: S. faecalis, S. faecium, S. gallinarum, S. avium, S. bovis y S. equinus. Las 4 primeras especies son considerados como Enterococos y se diferencian del resto de Estreptococos por su capacidad de crecer en cloruro de sodio al 6.5%, a un pH de 9.6 y a temperaturas de 10 y 45°C; son bacterias con morfología de óvalo, Gram positivos, se agrupan en pares o cadenas cortas y son catalasa negativa.

El hábitat normal de los estreptococos fecales es el tracto gastrointestinal de los animales de sangre caliente. S. faecalis y S. faecium  se observan con frecuencia en el hombre y con menor frecuencia: S. bovis, S equinus y S. avium, estos últimos se encuentran en gran número en las heces de animales.

Los enterococos son indicadores bacterianos de contaminación fecal en aguas recreacionales y potables. Estudios en aguas recreacionales dulces y de mar, sugieren que la gastroenteritis asociada con los bañistas, está relacionada directamente con la calidad del agua de baño y que los enterococos son los indicadores bacterianos más eficientes de la calidad de este tipo de aguas.  Este procedimiento aplica para todo tipo de aguas que no tengan altas turbiedades.

Objetivo
Describir el procedimiento para el recuento de Enterococos en muestras de agua por el método de filtración por membrana.

Equipos, Materiales y Reactivos
Frascos en borosilicato para la preparación de medios de cultivo, con tapa rosca resistente a la esterilización, Cajas de Petri desechables estériles, en material plástico, de aproximadamente 50-60 y 90 mm de diámetro, Membranas de filtración  estériles, de 47 mm de diámetro y poro de 0.45 mm, Horno microondas, Autoclave, Cabina de flujo laminar, Equipo de filtración, Incubadoras a temperaturas de 35 ± 1°C y 45 ± 0.5°C, Contador de colônias, Gradillas resistentes a la esterilización, Tubos de ensayo con tapa rosca, Microscopio, Agua estéril para dilución o lavado: destilada o peptonada al  0.1%, Medio de cultivo: Agar Estreptocócico - KF. Una vez preparado y esterilizado, sirva un volumen de 4 a 6 mL en cajas Petri de 50-60 mm de diámetro, deje solidificar, guarde en nevera en recipientes adecuados, debidamente rotulados y protegidas de la luz, Medio de cultivo: Agar Bilis Esculina, Cloruro 2, 3,5 Trifeniltetrazolium (T.T.C.): añada 1 mL al 1% de T.T.C. por cada 100 mL de medio de cultivo preparado, Peróxido de Hidrógeno al 3%, Caldo BHI: disuelva 37 gramos de caldo BHI en un litro de agua destilada. Mezcle bien, distribuya en tubos de ensayo y esterilice en autoclave, Agar BHI: adicione 15 gramos de agar bacteriológico por cada litro de caldo de BHI a preparar, mezcle, distribuya en tubos y esterilice en autoclave, Caldo BHI + 6.5% de NaCl: adicione 60 gramos de NaCl grado reactivo por cada litro de medio BHI, distribúyalo en tubos de 3 – 5 mL y esterilice, NaCl grado reactivo, Reactivo rojo de fenol como indicador de crecimiento. Si se utiliza el indicador rojo de fenol, para visualizar mejor el crecimiento de los microorganismos en caldo BHI y BHI + NaCl. Prepare una solución stock de colorante pesando 0.025 g  y en adiciónelo a 1 mL de agua destilada estéril. Agítelo y tome de esta solución 0,1 mL por cada 100 ml de medio de cultivo preparado antes de esterilizarlo, Coloración de Gram: Estas soluciones se adquieren comercialmente, en cuyo caso siga las instrucciones del fabricante para su uso.

Procedimiento

Para la recolección de muestras se utilizan frascos de vidrio o plástico, tapa rosca o esmerilada.

Selección del  volumen de muestra a filtrar
Un volumen ideal de muestra es aquel en el cual el número de colonias de Enterococos al momento de contarlas, se encuentran entre 20 y 60 UFC. Según la naturaleza de la muestra seleccione el volumen a filtrar, y de ser necesario, haga diluciones adecuadas. Las diluciones inferiores a 0.1 mL deben realizarse empleando factores de 10n, donde n = 1, 2,3...etc.
La alta turbiedad de la muestra puede saturar el filtro con materia orgánica o inorgánica e interferir en el crecimiento de los Enterococos. Por tanto, debe ser un factor a considerar para seleccionar el volumen de muestra a filtrar, incluida su posible dilución.
Para agua potable se filtra por lo general 100 mL. Como una guía para la filtración de otro tipo de aguas, empléese la misma utilizada para coliformes fecales .
Filtración de la muestra
Inicialmente y sin destapar el frasco de la muestra, ésta debe homogeneizarse mediante agitación manual.
Cuando se filtre menos de 50 mL de muestra, agregue 10 mL o más de agua de dilución al embudo antes de adicionar la muestra, con el propósito de conseguir una distribución homogénea de las bacterias sobre el filtro de membrana.
Una vez terminada la filtración de la muestra, enjuague el embudo adicionando de 20 a 30 mL de agua de dilución. Posteriormente, retire los embudos y coloque el filtro de membrana sobre  el medio de cultivo.  Evite la formación de burbujas o de arrugas en el filtro.

Incubación
Antes de incubarlas, mantener las placas por 30 minutos a temperatura ambiente y luego hacerlo en posición invertida por 48 horas a una temperatura de 35 ± 1°C.

Conteo de colonias
Cuente como Enterococos todas las colonias rosado a rojo oscuro. Si se realizan varias siembras de una misma muestra, cuente preferencialmente aquellas cajas que presentan entre 20 y 60 colonias sospechosas y no más de 200 de todos los tipos.

Pruebas de confirmación
El número de colonias a confirmar se hará de acuerdo a los siguientes criterios:
Para conteos menores de 5 colonias, confirme todas; para conteos entre 5-50 colonias, confirme por lo menos 5 colonias; para conteos entre 50-100 colonias, confirme el 10%, y para recuentos mayores de 100, confirme 10 colonias.
Tome colonias típicas del filtro de membrana, repíquelas a una caja con agar BHI e incube a 35 ± 1°C por 24 a 48 horas; realice las pruebas de catalasa y Gram y si éstas son positivas para Enterococos, repique a caldo BHI e incube a 35 ± 1°C por 24 ± 2 horas.
Transcurrido el tiempo de incubación, realice las siguientes pruebas a las colonias a confirmar.

Prueba de la catalasa : Adicione unas gotas de peróxido de hidrógeno al 3% sobre la superficie de un portaobjeto donde se haya colocado previamente la colonia; si hay desprendimiento de burbujas, la prueba es positiva y por lo tanto, no son Enterococos. Si la prueba es negativa, realícele los ensayos siguientes:

Coloración de Gram : Consta de cuatro soluciones: Cristal violeta (primer colorante), Lugol (yodo, solución mordiente), Alcohol acetona (decolorante) y Safranina (segundo colorante).

Técnica de coloración
Tome la colonia a examinar y mézclela con agua de dilución estéril, sobre la superficie de una lámina portaobjetos.
Déjela al medio ambiente hasta que seque
Fije la preparación al calor.  Para esto pásela unas tres veces sobre la superficie de la llama de un mechero de tal forma que la llama toque la parte inferior de la preparación.
Cubra la lámina portaobjeto con la solución de cristal violeta, espere un minuto, enjuague y escurra el exceso de agua.
Adicione la solución de yodo sobre la preparación, espere un minuto,  enjuague y escurra el exceso de agua.
Agregue suavemente alcohol acetona sobre la lámina inclinada y déjelo actuar por quince segundos, enjuague y escurra el exceso de agua.
Cubra la lámina con la solución de safranina durante treinta segundos, enjuague y escurra el exceso de agua y deje secar.
Observe al microscopio con el objetivo de 100X.

Interpretación
Una vez colocada y enfocada la lámina portaobjetos con aceite de inmersión, se observa la morfología de las células y la coloración. Los Enterococos son bacterias Gram + de forma ovoide y por lo general vienen agrupados en pares y cadenas cortas con coloración violeta.  

Otras pruebas
Siembre del tubo de BHI una asada a cada medio: agar bilis esculina e incube 35 ± 1°C por 48 ± 4 horas, caldo BHI + 6.5% de NaCl e incube a 35 ± 1°C  por 48 horas y caldo BHI e incube a 45 ± 0.5°C por el mismo tiempo.Si hay crecimiento en los 3 medios, la prueba se considera positiva para enterococos.
Los enterococos crecen en agar bilis esculina de color verde oliva a negro.

Cálculos y presentación de resultados
La siguiente ecuación permitirá el cálculo de las colonias una vez hayan sido confirmadas:

RF = (CT x CP / CC) 100 / V

Donde,

RF = Recuento final
CT = Conteo total de colonias de Enterococos
CC = Número de colonias confirmadas
CP = Número de colonias positivas
 V  = Volumen sembrado (en mL)

Como regla, aproxime al número entero inmediatamente superior, cuando el decimal es mayor o igual a 0.5. Pero mantenga el entero que precede al decimal, cuando este último es menor a 0.5. Realice estas aproximaciones en los resultados finales.
El conteo ideal se realiza en las cajas que presentan  entre 20 y 60 UFC. Si hay más de una caja con recuentos dentro de este rango, informe el promedio. De no haber cajas en el rango ideal, considérelas todas, incluidas aquellas sin crecimiento.
Si no hay presencia de Enterococos al filtrar 100 mL de muestra, técnicamente se debería informar como < 1 UFC/100 mL. Sin embargo, para propósitos prácticos y evitar confusiones en los informes emitidos para personal no especializado, informe como 0 UFC/100 mL de muestra.

Si se presenta un crecimiento que cubra la totalidad o parte del área de filtración  y no se observa claramente separación entre colonias, tomar del filtro una muestra representativa para su confirmación. En función de su resultado se informará: Si es positivo como "crecimiento confluente, con Enterococos". De ser negativo se reportará como “crecimiento confluente con colonias sugestivas de Enterococos”. En este caso se sugiere repetir la muestra con el fin de confirmar el resultado.
Si el crecimiento total de colonias supera las 200, se reportará como: “muy numerosas para ser contadas” (MNPC).

Para informes técnicos requeridos en detalle, y en el caso de que se haya procesado menos de 100 mL de muestra y ésta hubiese dado como resultado cero (0) Enterococos, informe el resultado como 0 UFC sobre la cantidad de mL de muestra procesada; ej. 0 UFC/10 mL.
Para expresar el resultado final y con el fin de evitar confusiones, cuando el valor es hasta de 3 dígitos, repórtelo como se obtuvo; para resultados superiores, expréselo en notación científica usando dos cifras significativas. Este resultado se informa como UFC/100 mL.

Bibliografía

• APHA-AWWA-WEF (2012) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 22nd Edition. 9-112 a 9-115, método 9230 C.

• KONEMAN ELMER,  Washington C. Winn,  Stephen D. Allen, William M. Janda , ,Gary W. Procop, Paul C. Schrenckenberger, Gail L. Woods (2008) Diagnostico Microbiológico, Texto y Atlas a color. Sexta edición, Editorial Panamericana.