BIOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

• TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBOS MÚLTIPLES PARA COLIFORMES TOTALES Y FECALES

Los coliformes están conformados por varios géneros bacterianos de la familia Enterobacteriaceae y la definición clásica de este grupo está basada en la fermentación de la lactosa. Cuando se usa la técnica de fermentación de tubos múltiples, el grupo coliforme se define como: bacterias Gram negativas, anaerobias facultativas, no esporuladas, en forma de bastón, fermentadoras de la lactosa con producción de gas y ácido en 48 horas a una temperatura de 35°C. Los coliformes fecales, además, fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 44.5°C. 

En la  técnica de fermentación por tubos múltiples, los resultados se expresan en términos de Número Más Probable (NMP) en 100 mL. Este número está basado en ciertas fórmulas de probabilidad y es un estimado de la densidad media de coliformes en la muestra.
La precisión de cada prueba es función de:
El número de diluciones realizadas que depende de la experiencia del analista y la procedencia de la muestra; es inversamente proporcional.
Presencia de gas y turbiedad en algunos o todos los tubos con mayor inóculo, directamente proporcional.
Ausencia de gas y turbiedad en algunos o todos los tubos con menor inóculo, inversamente proporcional.
La técnica tiene 3 fases: presuntiva, confirmativa y completa. En la fase presuntiva se utiliza el caldo lauril triptosa y la fase confirmativa para coliformes totales utiliza el caldo verde bilis brillante y para coliformes fecales el caldo EC. La fase completa se realiza para llevar un control de calidad y permite establecer o no la presencia de coliformes.
 
Objetivo
Describir la metodología analítica para la estimación de la densidad bacteriana de coliformes totales y coliformes fecales por la técnica de fermentación en tubos múltiples.

Equipos, Materiales y Reactivos
Frascos para la preparación de medios de cultivo, con tapa rosca resistentes a la esterilización por autoclave, Pipetas mecánicas para diferentes volúmenes y puntas estériles acorde a la pipeta seleccionada, Autoclave, Cabina de flujo laminar, Tubos de borosilicato tapa-rosca esterilizables de dimensiones (en mm): 13  x 100, 16 x 150, 20 x 150 y 25 x 150, Incubadora con temperatura de 35 ± 1°C, Baño María a temperatura de 44.5 ± 0.5°C, Microscopio, Caldo lauril triptosa, Caldo bilis verde brillante, Caldo EC, Agua estéril para dilución o lavado: destilada o peptonada al  0.1%, Reactivos para realizar coloración de Gram, Agar Nutritivo, Aceite de inmersión, Agar McConkey o agar tipo Endo LES.

Procedimiento
Este procedimiento aplica para determinar el número estimado de coliformes totales y fecales en todo tipo de agua, aunque no está permitido por la legislación actual para agua potable. Las condiciones ambientales de temperatura y humedad, no son críticas para la realización de este ensayo. La dilución (de ser necesaria)  y la siembra de la muestra, deben realizarse en la cabina de flujo laminar.
Selección del  volumen de la muestra a inocular
Según la naturaleza de la muestra, seleccione las diluciones a emplear en la fase presuntiva, teniendo presente que cada una está compuesta por una serie de cinco tubos.         
Elija la cantidad de muestra a sembrar con base en la densidad probable de coliformes presentes en la muestra y siembre en cada una de las series las cantidades de muestra o la dilución correspondiente.
Para decidir el número de series a emplear y la cantidad de su inóculo, tenga en cuenta las experiencias anteriores, la procedencia de la muestra y el hecho de que en época de lluvia, el número de coliformes puede aumentar en 1 o más diluciones en las aguas superficiales incluidas las de ciénagas y mar mientras que su número puede disminuir en las aguas residuales domésticas.
En la medida que se sospeche un alto número de coliformes, la cantidad de muestra a inocular será menor. Por ejemplo, para un agua con una probable densidad escasa de coliformes,  siembre 5 tubos por cada una de las siguientes concentraciones de muestra: 10, 1, 0.1, 0.01 mL. Por lo general, se utilizan de 3 a 5 series de tubos.
Diluciones
La muestra y sus respectivas diluciones deberán ser agitadas antes de proceder a sembrarlas o a realizar otras diluciones. Cuando sea necesario, haga las diluciones decimales pertinentes; para esto, emplee tubos o frascos de dilución con un volumen fijo de 9 ó 99 mL de agua de dilución estéril. Tenga presente que una vez esterilizados los frascos, el  volumen de diluyente puede disminuir, por lo que se requerirá restablecer su cantidad antes de utilizarlos.
Considere el volumen de 1 mL de muestra como la concentración de 100. Para realizar una dilución 10-1, adicione 11 mL de muestra a 99 mL de diluyente  ó 1 mL de muestra a 9 mL de diluyente. Para realizar una dilución 10-2,  agregue 1 mL de muestra a 99 mL de diluyente ó  0.1 mL de muestra a 9.9 mL de diluyente. Si desea obtener una dilución decimal mayor haga las diluciones correspondientes a partir de la dilución inmediatamente anterior y sume los decimales para conocer la dilución final.  Cuando la muestra sea turbia, nunca siembre directamente 0.1 mL o menos; en estos casos, emplee 1 u 11 mL de muestra para realizar la dilución correspondiente.
Siembra e incubación de la muestra
Fase Presuntiva:
El medio de cultivo utilizado es el caldo lauril triptosa. Una vez realizada las diluciones necesarias, siembre el mismo volumen en cada uno de los 5 tubos de la serie, agítelos o mézclelos por inversión e incúbelos a 35 ± 1°C. A las 24 ± 2 horas, observe turbiedad en el medio y/o producción de gas en el tubo Durham e incube nuevamente aquellos tubos negativos hasta 48 ± 3 horas para detectar los coliformes que son fermentadores lentos de la lactosa. La prueba será positiva si hay crecimiento con producción de gas dentro de las 48 horas. 

Fase Confirmativa:
1) Coliformes totales
Sistemáticamente, confirme aquellos tubos que hayan resultado positivos a las 24 ± 2 horas y  proceda igual con aquellos tubos que hayan resultado positivos a las 48 ± 3 horas.
Para esto, siembre en caldo bilis verde brillante, una o más asadas del tubo positivo. La presencia  de gas y turbiedad que aparezca en los tubos durante un período de incubación de 6 a 48 ± 3 horas a 35 ± 1°C, será considerada positiva la prueba confirmativa de coliformes totales.
Procedimiento alternativo para confirmar los Coliformes Totales
Cuando se procesan aguas residuales o se conoce que el agua es contaminada y todos los tubos de la fase presuntiva son positivos en 2 ó más diluciones consecutivas dentro de las 24 horas, someta únicamente a confirmación aquellos tubos de la más alta dilución en el cual todos los tubos son positivos y cualquier tubo positivo después de estos.

2) Coliformes fecales
Repicar los tubos positivos de la fase presuntiva en caldo EC e incubar a 44.5 ± 0.5°C hasta por 24 ± 2 horas en baño serológico. La turbiedad y producción de gas en los tubos, significa que la prueba confirmativa es positiva para coliformes fecales.

Lectura
La lectura final de la prueba se hace una vez terminado el tiempo de incubación de la fase confirmativa y se anotan como tubos positivos para coliformes totales y fecales, aquellos en los que haya crecimiento con formación de gas y turbiedad.
Una vez contados el número de tubos positivos de cada una de las series, proceder a elegir a 3 de éstas. Para seleccionarlas, tenga en cuenta los criterios dados a continuación y simultáneamente observe los ejemplos de la tabla N° 2.
Elimine la dilución más alta (menor volumen) si tiene todos los tubos negativos y queda al menos una dilución con un tubo negativo. Elimine la más baja dilución (mayor volumen de muestra)  si todos los tubos son positivos y queda al menos una dilución con un tubo positivo (ejemplo a).
Si la más baja dilución no tiene todos los tubos positivos y algunas de las mayores diluciones tiene todos los tubos negativos, elimine éstas últimas (ejemplo b).
Si la mayor dilución con todos los tubos positivos difiere no más de dos diluciones de la mayor dilución con algún tubo positivo, seleccione la mayor dilución con algún tubo positivo y las otras dos diluciones inmediatamente más bajas (ejemplos c y d).
Si después de eliminar la menor dilución con todos los tubos positivos, ninguna otra tiene todos los tubos positivos, seleccione las dos diluciones más bajas y asigne la suma de los tubos positivos de las diluciones remanentes a la tercera dilución (ejemplo e).
Si ninguna dilución tiene todos los tubos positivos, seleccione las dos diluciones más bajas y asigne la suma de los tubos positivos de las diluciones remanentes a la tercera dilución (ejemplo f).
Si la combinación obtenida en f no aparece en la tabla, seleccione la mayor dilución con al menos un tubo positivo y las dos diluciones inmediatamente menores (ejemplo g).
Una vez elegidas las 3 series a tener en cuenta para la búsqueda del NMP, proceda a buscarlo en la Tabla 3. 

Tabla 2. Ejemplos para la selección de tubos positivos.
          ________________________________________________________________
                                      10      1        0.1     0.01   0.001      Combinación       NMP            
              Muestra           mL    mL      mL      mL       mL        de Positivos     /100 mL
           ________________________________________________________________
                    a                 5       5         1        0          0                5-1-0              330
                    b                 4       5         1        0          0                4-5-1                48  
                    c                 5       2         5        2          1                5-2 1 7000
                    d                 4       5         4        5          1                4-5-1             4800
                    e                 5       4         4        0          1                4-4-1               400
                    f                  4       3        0         1          1                4-3-2                39  
                    g                 4       3        3         2          1                3-2-1             1700 
           ________________________________________________________________

Fase completa
Para confirmar la presencia de  bacterias coliformes y como control de calidad del procedimiento, es necesario realizar la fase completa en al menos el 10% de los tubos positivos de caldo verde bilis brillante de la fase confirmativa, de la siguiente manera:
Siembre por aislamiento cada uno de los tubos positivos seleccionados en agar Endo LES o agar MacConkey, incube las placas invertidas por 24 ± 2 horas a 35 ± 1°C.
Transcurrido el tiempo de incubación, tome al menos una colonia típica (en agar Endo LES son de color rosa a rojo oscuro con un brillo metálico y en agar Mcconkey se ven rojas con una zona opaca) y si hubiese colonias atípicas, tome al menos dos; siémbrelas
En agar nutritivo inclinado e incube a 35 ± 1°C por 24 ± 2 horas. De ocurrir crecimiento, realice la coloración de Gram (véase IE_51).
En caldo lauril triptosa con tubo de Durham e incube 35 ± 1°C hasta 48 horas.
La formación de gas y la presencia de cocobacilos Gram negativos no esporulados, constituyen un resultado positivo de la prueba completa.

Con el objetivo de conocer la precisión, deben analizarse periódicamente duplicados. Estos se tomarán de la misma muestra original y serán analizados como dos submuestras, ambas con el número de tubos y diluciones semejantes a si se tratara de una muestra única.

Cálculos y presentación de resultados
Los resultados se informarán en NMP/100 mL. Elabore el respectivo informe colocando un máximo de 3 dígitos, en el caso de que existan más, informe 2 dígitos con su respectivo exponencial. También se podrá aproximar los valores de NMP fraccionados a enteros con el fin de evitar confusiones en personal no especializado.
Como regla general, aproxime al número entero inmediatamente superior, cuando el decimal es mayor e igual a 0.5 y mantenga el entero que precede al decimal, cuando este último es menor a 0.5. Realice estas aproximaciones en operaciones intermedias y en los resultados finales.
Cuando se haga necesario sumar varios valores de NMP para convertirlos en un solo valor, use la media geométrica que se calcula promediando cada uno de los logaritmos de los valores del NMP. Ejemplo, la media geométrica de A, B y C es 10L  donde:

                           L= (log10A + log10B + log 10C) / 3

El valor de la media se reportará como el antilogaritmo  de L.

Por último, si la combinación de tubos positivos no aparece en la Tabla 3. o se emplean otras combinaciones de tubos o diluciones, calcule los valores de NMP de la siguiente manera:
Seleccione la más baja dilución que no tenga todos los tubos positivos.
Seleccione la más alta dilución con al menos un resultado positivo.
Finalmente, seleccione todas las diluciones entre éstas.
Ejemplo: De (5/5, 10/10, 4/10, 1/10, 0/5 únicamente utilice (-, -, 4/10, 1/10, -), 4/10 y 0.1 mL muestra/tubo y 1/10 y 0.01 mL muestra/tubo; de (5/5, 10/10, 10/10, 0/10, 0/5) únicamente seleccione (-, -, 10/10, 0/10, -) 10/10 y 0.1 mL muestra/tubo y 0/10 y 0.01 mL muestra/tubo.

Únicamente utilice las diluciones seleccionadas en la fórmula de Thomas dada a continuación:

NMP/100 mL (aproximadamente) = 100 x P/(N x T)1/2
 Donde:
        P = número de tubos positivos
        N = volumen de muestra en todos los tubos negativos combinados, mL
        T = volumen total de muestra en las diluciones seleccionadas

En el primer ejemplo dado anteriormente quedaría: 
NMP/100 mL (aproximado) = 100 x 5/(0.69 x 1.1)1/2  = 500/0.87 = 570/100 mL

Para el segundo ejemplo anterior:

NMP/100 mL (aproximado) = 100 x 10/(0.1 x 1.1)1/2 = 1000/0.332 = 3000/100 mL.

Los cálculos realizados en los dos ejemplos anteriores corresponden a valores aproximados. Los valores reales de NMP respectivos serían 590/100 mL y 2400/100 mL.

El segundo ejemplo dado anteriormente, es un caso especial  en el cual una solución puede ser calculada -con exactitud- directamente de las 2 diluciones seleccionadas. En consecuencia, cuando todos los resultados de las diluciones más bajas son positivas y todos los resultados de las diluciones más altas son negativas seleccione las diluciones de la siguiente forma:

NMP/100 mL = (1/v) [ 230.3 log10 (T/N)]

Donde T y N se definen en la fórmula de Thomas.

En el segundo ejemplo teníamos: (5/5, 10/10, 10/10, 0/10, 0/5), con porciones de muestra de 10, 1, 0.1, 0.01 y 0.001 mL. La tercera dilución es la más alta con tubos positivos, por lo que v = 0.1  y el NMP para la tercera y cuarta diluciones será exacto.

NMP/100 mL = (1/0.1) x  [230.3 log10 (1.1/0.1)] = 2400/100 mL

Bibliografía

• APHA-AWWA-WEF (2012) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 22th Edition. 9-66 a 9-72, métodos 9221 B y C.