BIOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

• RECUENTO DE Pseudomonas sp

El género Pseudomona comprende a microorganismos caracterizados por ser bacilos Gram negativos rectos o ligeramente curvos, son aerobios estrictos; la mayoría de cepas son móviles, utilizan la glucosa y otros hidratos de carbono oxidativamente, y por lo general son citocromo oxidasa positivos. La importancia de su determinación radica que este género ha sido encontrado en suministros de agua, especialmente de hospitales ocasionando infecciones del tracto urinario y respiratorio entre otras. Este procedimiento aplica para todo tipo de aguas.

Objetivo
Describir el procedimiento para el recuento de Pseudomonas sp. en muestras de agua por el método de filtración por membrana.

Equipos, Materiales y Reactivos
Frascos en borosilicato para la preparación de medios de cultivo, con tapa rosca resistente a la esterilización, Cajas de Petri desechables estériles, en material plástico, de aproximadamente 50-60 mm de diámetro, Membranas de filtración  estériles, de 47 mm de diámetro y poro de 0.45 mm, Pipetas mecánicas de diferentes volúmenes y puntas estériles acorde a la pipeta seleccionada, Horno microondas, Autoclave, Cabina de flujo laminar, Equipo de filtración, Incubadora a temperatura entre 25 y 30°C, Contador de colônias, Lámpara de luz ultravioleta de onda larga, Agua estéril para dilución o lavado: destilada o peptonada al  0.1%, Medio de cultivo: Pseudomonas Agar Base (Oxoid), Glicerina, CFC Selective Agar Supplement: añadir 1 vial rehidratado con 2 mL de agua destilada estéril/ etanol (1:1) a 500 mL de medio preparado, La preparación de los medios de cultivo, siga las instrucciones del fabricante.

Procedimiento
Para la recolección de muestras se utilizan frascos de vidrio o plástico, tapa rosca o esmerilada. Las condiciones ambientales de temperatura y humedad, no son críticas para la realización de este ensayo. La dilución (de ser necesaria)  y la siembra de la muestra, deben realizarse en la cabina de flujo laminar.

Selección del  volumen de muestra a filtrar
Un volumen ideal de muestra es aquel en el cual el número de colonias de Pseudomonas sp. al momento de contarlas, se encuentran entre 20 y 80 UFC. Para agua potable por lo general se filtran 100 mL. Para aguas tratadas y no tratadas con baja turbiedad, la cantidad de muestra a filtrar se establece entre 1 y 100 mL. Para aguas no tratadas con alta turbiedad se utilizan 0.5 mL de muestra.  No obstante, según la naturaleza y el aspecto de la muestra, seleccione el volumen a filtrar, y de ser necesario, haga diluciones adecuadas. Las diluciones inferiores a 0.1 mL deben realizarse empleando factores de 10n, donde n = 1, 2, 3...etc. Como una guía para la filtración de otro tipo de aguas, empléese la misma utilizada para coliformes fecales.

Filtración de la muestra
Inicialmente y sin destapar el frasco de la muestra, ésta debe homogeneizarse mediante agitación manual.
Cuando se filtre menos de 50 mL de muestra, agregue 10 mL o más de agua de dilución al embudo antes de adicionar la muestra, con el propósito de conseguir una distribución homogénea de las bacterias sobre el filtro de membrana.
Una vez terminada la filtración de la muestra, enjuague el embudo adicionando de 20 a 30 mL de agua de dilución. Posteriormente, retire los embudos y coloque el filtro de membrana sobre  el medio de cultivo. Evite la formación de burbujas o de arrugas en el filtro.

Incubación
Coloque las cajas de Petri en posición invertida por un período de 48 horas en una incubadora a temperatura entre 25 - 30°C.

Conteo de colonias
Cuente como colonias de Pseudomonas sp. Aquellas que presenten un color azul verdoso o pardo característico y un verde fluorescente bajo luz ultravioleta.

Cálculos y presentación de resultados
La siguiente ecuación permitirá el cálculo de las colonias:

RF = CT (100)  / V
Donde,

RF = Recuento final
CT = Conteo total de colonias de Pseudomonas sp.
 V  = Volumen sembrado (en mL)

Como regla, aproxime al número entero inmediatamente superior, cuando el decimal es mayor o igual a 0.5. Pero mantenga el entero que precede al decimal, cuando este último es menor a 0.5. Realice estas aproximaciones en los resultados finales.

El conteo ideal se realiza en las cajas que presentan  entre 20 y 80 UFC. Si hay más de una caja con recuentos dentro de este rango, informe el promedio. De no haber cajas en el rango ideal, considérelas todas, incluidas aquellas sin crecimiento.

Si no hay presencia de Pseudomonas sp. al filtrar 100 mL de muestra, técnicamente se debería informar como < 1 Pseudomonas sp./100 mL. Sin embargo, para propósitos prácticos y evitar confusiones, en los informes emitidos para personal no especializado, informe como 0 Pseudomonas sp/100 mL de muestra.

Para informes técnicos requeridos en detalle, y en el caso de que se haya procesado menos de 100 mL de muestra y ésta hubiese dado como resultado cero (0) Pseudomonas, informe el resultado como 0 UFC sobre la cantidad de mL de muestra procesada, -ej. 0 UFC/10 mL.

Si se presenta un crecimiento que cubra la totalidad o parte del área de filtración y no se observa claramente separación entre colonias, tomar del filtro una muestra representativa para su confirmación. En función del resultado, se informará: si es positivo, reportar como “crecimiento confluente con Pseudomonas”; de ser negativo, reportar como “crecimiento confluente con colonias sugestivas de Pseudomonas”. En este último caso, se sugiere repetir la muestra con el fin de confirmar el resultado.

Si el crecimiento de colonias en el medio supera las 100 colonias, se reportará como: “Muy numerosas para ser contadas” (MNPC).

Para expresar el resultado final y con el fin de evitar confusiones, cuando el valor es hasta de 3 dígitos, repórtelo como se obtuvo; para resultados superiores, expréselo en notación científica usando dos cifras significativas. Este resultado se informa como UFC/100 mL.

Bibliografía

• APHA-AWWA-WEF (2005) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21th Edition. New York, 9-33 y 9-63.
• OXOID (1998). The OXOID MANUAL, Hampshire, págs. 2 -171 y 172.
• KONEMAN ELMER,  Washington C. Winn,  Stephen D. Allen, William M. Janda , ,Gary W. Procop, Paul C. Schrenckenberger, Gail L. Woods (2008) Diagnostico Microbiológico, Texto y Atlas a color. Sexta edición, Editorial Panamericana.