BIOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

• RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

Los mohos y levaduras son microorganismos eucariotes ampliamente distribuidos en la naturaleza, la mayoría de ellos son saprofitos pero algunos de ellos pueden llegar a ser dañinos para el ser humano y de otros seres vivos llegando a producir diferentes patologías clasificadas como: micosis profundas, oportunistas, subcutáneas y superficiales. Este procedimiento aplica para todo tipo de aguas.

Objetivo

Describir el procedimiento para el recuento de mohos y levaduras (MYL) en muestras de agua por el método de filtración por membrana.

Equipos, Materiales y Reactivos

Frascos en borosilicato para la preparación de medios de cultivo, con tapa rosca resistente a la esterilización, Cajas de Petri desechables estériles, en material plástico, de aproximadamente 50-60 mm de diámetro, Membranas de filtración  estériles, de 47 mm de diámetro y poro de 0.45 mm, Horno microondas, Autoclave, Cabina de flujo laminar, Equipo de filtración, Incubadora a temperatura  de 20 ± 1°C, Contador de colônias, Microscopio, Agua estéril para dilución o lavado: destilada o peptonada al  0.1%, Medio de cultivo: agar extracto de Malta No. 1 ó 2, al que se adicionan los antibióticos estreptomicina y tetraciclina. Para la preparación del medio de cultivo vea IL_141. En cualquier caso siga las instrucciones del fabricante. 

Procedimiento

Para la recolección de muestras se utilizan frascos de vidrio o plástico, tapa rosca o esmerilada. Las condiciones ambientales de temperatura y humedad, no son críticas para la realización de este ensayo. La dilución (de ser necesaria)  y la siembra de la muestra, deben realizarse en la cabina de flujo laminar.

Selección del volumen de muestra a filtrar

Según la naturaleza y las características de la muestra, seleccione el volumen a filtrar, y de ser necesario, realice las diluciones adecuadas. Un volumen ideal de muestra es aquel en el que se obtienen entre 20 y 80 colonias de mohos y levaduras en la superficie de la membrana.
Para diluciones inferiores a 0.1 mL., utilice diluciones por factores de 10n, donde n = 1, 2, 3...
Como una guía, para agua potable, filtre 100 mL. Para otros tipos de agua, siembre diluciones 1:10 para aguas de arroyos y de 1:100 a 1:1000 para muestras con un contenido abundante de sedimento.

Filtración de la muestra
Inicialmente y sin destapar el frasco de la muestra, ésta debe homogeneizarse mediante agitación manual.
Cuando se filtre menos de 50 mL de muestra, agregue 10 mL o más de agua de dilución al embudo antes de adicionar la muestra, con el propósito de conseguir una distribución homogénea de las bacterias sobre el filtro de membrana.
Una vez terminada la  filtración de la muestra, enjuague el embudo adicionando de 20 a 30 mL de agua de dilución. Posteriormente, retire los embudos y coloque el filtro de membrana sobre  el medio de cultivo. Evite la formación de burbujas o de arrugas en el filtro.

Incubación
Coloque las cajas de Petri en posición invertida dentro de la incubadora a 20 ± 1°C durante 3  días. En caso de no obtener crecimiento, prolongue la incubación por dos días más.

Conteo de colonias
Cuente como colonias de mohos todas aquellas de aspecto algodonoso en diversos colores como verde, amarillo, naranja, rojo, café, azul y negro, y como levaduras aquellas con aspecto mucoide en igual gama de colores descritos para los mohos.
Si el conteo s va a postergar mantenga las placas no más de 24 horas a 4oC.

Cálculos y presentación de los resultados

La siguiente ecuación permitirá el cálculo de las colonias:

RF = CT x 100 / V
Donde,

RF = Recuento final
CT = Conteo total de colonias de mohos y levaduras presentes en la superficie de la membrana
 V  = Volumen sembrado (en mL)

Como regla general, aproxime al número entero inmediatamente superior, cuando el decimal es mayor e igual a 0.5. Por otro lado, mantenga el entero que precede al decimal, cuando este último es menor  0.5.  Realice estas aproximaciones en los resultados finales.

Seleccione para conteo aquellas cajas que presenten entre 20 y 100 colonias de mohos y levaduras, aunque el recuento ideal está entre 20 y 80 colonias. Si hay más de una caja con recuentos dentro de este rango, informe el promedio. Para crecimientos por debajo de 20 colonias, use este dato y realice los cálculos. Si por el contrario, el crecimiento es abundante y se dificulta el recuento reporte como “muy numerosas para ser contadas” (MNPC). Cuando el crecimiento ocupa toda la superficie de la caja y es muy difícil diferenciar una colonia de otra, informar como “crecimiento confluente”.

Para informes técnicos requeridos en detalle, y en el caso de que se haya procesado menos de 100 mL de muestra y ésta hubiese dado como resultado cero (0) Mohos y levaduras, informe el resultado como 0 UFC sobre la cantidad de mL de muestra procesada, -ej. 0 UFC/10 mL.

Si no hay presencia de MYL, técnicamente se debería informar como < 1 UFC de MYL/100 mL, sin embargo, para propósitos prácticos y evitar confusiones, en los informes emitidos para personal no especializado, informe como 0 UFC de MYL/100 mL.

Para expresar el resultado final y con el fin de evitar confusiones, cuando el valor es hasta de 3 dígitos, repórtelo como se obtuvo; para resultados superiores, expréselo en notación científica usando dos cifras significativas. Este resultado se informa como UFC/100 mL.

Bibliografía

• APHA-AWWA-WEF (2005) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21th Edition. New York, 9 -153, 154 y 158, método 9610D.
• SCHARLAU (2006) Handbook of Microbiological Media. Edition No. 9, Barcelona, pág. 99.