BIOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

• OBSERVACIÓN DE BACTERIAS (TINCIÓN DE GRAM)

Antiguamente los biólogos habían dividido el mundo animal en dos reinos: Plantas y animales. Con el desarrollo del microscopio se hizo evidente que algunos organismos no podían ser considerados como tales. Ernest Haeckel, estableció la presencia de un tercer reino: El Protista.
En 1937 Edouard Chatton sugirió el termino procariótico (significa antes del núcleo), para describir bacterias y el término euariótique (significa núcleo verdadero) para describir las demás células. Con el desarrollo de la microcopía electrónica y las técnicas bioquímicas, se revelaron diferencias celulares básicas que inspiraron muchas propuestas de nuevas clasificaciones. En 1969 R.H. Whitaker propuso la clasificación de cinco reinos que ha sido aceptada por la mayoría de los biólogos, sugiriendo la clasificación de los hongos en un reino aparte del reino Fungí, y no como parte del reino vegetal debido a que los hongos no son fotosintéticos y deben absorber nutrimentos producidos por otros organismos.
De esta forma quedaron los cinco reinos reconocidos por los biólogos; Esta tinción fue desarrollada empíricamente por Christian Gram en 1884. A pesar del tiempo transcurrido, la tinción apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificación bacteriana. La técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram positivas (G+) y Gram negativas (G-).
La tinción de Gram requiere cuatro soluciones:
1. Primer colorante: Es un colorante básico que en contacto con las células cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta.
2. Solución mordiente: Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes empleados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases, como, p.ej., el Lugol.
3. Agente decolorante: es un disolvente orgánico, p.ej. alcohol-acetona (1:1).
4. Colorante de contraste: Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como, p.ej., la safranina o la fucsina.
Los dos grupos bacterianos que distingue esta técnica difieren en el color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram+ se teñirán de azul por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram- perderán la coloración inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teñirán de rosa debido a la safranina. La diferencia está determinada por la composición de su envoltura celular. Las Gram+ poseen una malla de peptidoglicano en su parte más externa, mientras que las Gram-, recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la célula.
Una de las precauciones al realizar esta tinción es la de trabajar con cultivos en fase exponencial. De lo contrario se pueden obtener resultados falsos. P.ej. las bacterias Gram+ en fase estacionaria pueden aparecer como Gram-.

Objetivos
Conocer la composición de las células procarióticas
Conocer algunos representantes del reino procariótico
Identificar las bacterias Gram. positivas y Gram. negativas

Materiales, Equipos y Reactivos

Microscopio, Mechero, Portaobjetos, Palillo, Aceite de inmersión y Coloración de Gram.

Procedimiento
En la presente técnica se realizará la observación de organismos representantes de los tres reinos Procarióticos, Protista y Fungí.
Observación de bacterias : Con un palillo de dientes retire un poco de sarro dental y prepare un extendido fino, deje secar al aire. Fije el material pasando el portaobjeto tres o cuatro veces por la lama del mechero, controlando la temperatura con el dorso de la mano. Agregue cristal violeta hasta cubrir la muestra y deje actuar el colorante por un minuto, lave la muestra con agua del chorro. Cubra la preparación con yodo de Gram. durante un minuto, lave suavemente. Agregue alcohol  acetona cuando la preparación no desprenda mas colorante, requiere diez segundos. Lave con agua. Cubra la preparación con fucsina básica o safranina durante un minuto, lave con agua y deje que escurra el exceso. Seque la muestra al aire libre. Examine con mayor aumento y con objetivo de inmersión.

Desarrolle:
Las bacterias se observan de color violeta y de color rosa.
Las violetas se llaman Gram. positivas.
Las rosadas se llaman Gram. negativas.
¿Qué estructuras u organelos diferencia?
¿Por qué las diferencias en el color de las bacterias?
Cuáles son las funciones de los diferentes componentes del colorante de Gram?

Bibliografía

• LODISH Harvey and Arnold Berk. 2005. Biología Celular y Molecular. 5 edición Editorial Panamericana
• SOLOMÓN .2008. Biología. Octava edición Editorial Mc Graw-Hill.