As sementes dos diferentes taxa foram recolhidas em habitat natural (Tabela 5) e mantidas à temperatura ambiente até ao início das experiências.
Tabela 5: Dados da colheita de sementes para cultura in vitro.
Taxa |
Data e local de colheita das sementes /coordenadas GPS |
1. Daucus carota subsp. halophilus |
Junho. Cabo de São Vicente, Algarve. 37° 1' 30" N 8° 59' 40" W. |
2. Distichoselinum tenuifolium |
Agosto. Moncarapacho, Algarve. 37° 8 ' 41" N 7°7' 88 " W. |
3. Angelica pachycarpa |
Maio. Ilha Berlenga. 39° 24′ N 9° 30′ W. |
4. Seseli montanum subsp. peixotoanum |
Setembro a novembro. Alimonde-Carrazede e Samil-Bragança, Trás-os-Montes. 41° 48' N 06° 45' W. |
5. Eryngium duriaei |
Setembro. Mata da Margaraça e Serra da Estrela. 40° 19' 18.72" N e 7° 36' 46.68" W. |
No caso de Daucus carota subsp. halophilus utilizaram-se também segmentos nodais (até 1,5 cm comprimento) de plantas silvestres colhidas no Cabo de São Vicente, no Algarve, durante o mês de abril.
Numa segunda fase, na indução de embriogénese somática, foram usadas, nas mesmas condições, sementes de plantas micropropagadas de Angelica pachycarpa e de Distichoselinum tenuifolium instaladas em viveiro no Jardim Botânico da Universidade de Coimbra.
A esterilização das sementes para ulterior isolamento e cultura de diferentes porções das plântulas (ápices caulinares, segmentos de raiz, de pecíolo e de folhas cotiledonares) e dos segmentos nodais seguiu um procedimento similar em todos os taxa testados. Assim, procedeu-se primeiro a um tratamento com etanol (90 % v/v) durante 1 min. seguido de transferência para uma solução de hipoclorito de cálcio a 7 % (p/v) contendo 2-3 gotas de Tween-20, durante 20 min. Após três lavagens em água bidestilada esterilizada, o material ficou em embebição durante a noite. De seguida procedeu-se a uma nova esterilização seguindo o mesmo procedimento com hipoclorito de cálcio e em condições assépticas, numa câmara de fluxo laminar.
Dependendo do tamanho, 3 a 10 sementes foram inoculadas em tubos de ensaio contendo o meio MS (Murashige e Skoog, 1962) com os macronutrientes reduzidos a metade da concentração e 3% de sacarose. O pH de todos os meios foi ajustado a 5,8 com KOH (0,1-1,0N) tendo-se em seguida adicionado 0,6 % de agar (Merck). Os meios foram autoclavados a 121ºC (120 kPa) durante 20 min. No caso das culturas in vitro de Seseli montanum subsp. peixotoanum o pH foi ajustado para valores de 6,0-6,2.
Após 30-45 dias de germinação in vitro das sementes, diferentes tipos de explantes, para estabelecimento das culturas em meios de crescimento in vitro, foram isolados a partir das plântulas, nomeadamente:
1 - ápices caulinares (até 0,5 cm);
2 - raiz (porções apicais 0,5-1 cm);
3 - folhas cotiledonares (limbo do primeiro par de folhas – segmentos foliares 0,5-1 cm);
4 - pecíolos do primeiro par de folhas (0,5-1 cm).
As culturas foram mantidas a 25ºC, numa câmara de cultura sob um regime de iluminação diária (16h de luz) de 15-20 µmol m−2 s−1, de radiação fotossinteticamente ativa, fornecida por lâmpadas de luz fria, fluorescente e branca.
Os explantes utilizados, os meios de cultura e os tipos de resposta morfogénica verificados nos diferentes taxa foram diferentes. Nas secções seguintes são descritos os ensaios realizados com cada um dos taxa testados.
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