Daucus carota subsp. halophilus

Proliferação de meristemas

Os ápices caulinares das plântulas foram cultivados em meio MS suplementado com diferentes concentrações de BA (benziladenina) (0,1; 0,2; 0,5; 1 e 2 mg/L) e 3% de sacarose. O meio base MS foi usado como controlo.
O número de rebentos caulinares, formados a partir dos explantes iniciais, foi registado após 4 semanas de cultura; o explante inicial (parte basal do rebento caulinar formado in vitro - stump) foi subcultivado por mais 4 semanas, nas mesmas condições de cultura, e feito novo registo desta segunda inoculação, também após 4 semanas.
Nas duas fases de cultura foi avaliado o número de rebentos caulinares em função da concentração de BA.

Enraizamento

Os rebentos isolados (2,0-3,0 cm) formados nas condições acima referidas foram induzidos a formar raiz em meio MS contendo 0,1 mg/L de IBA (ácido-3-indol butírico), ou no mesmo meio base (completo ou a ½ da concentração base) sem reguladores de crescimento.
O enraizamento foi avaliado após um mês e meio de cultura.
As plântulas enraizadas (comprimento da raiz de, pelo menos, 2 cm) foram retiradas dos tubos de ensaio, separadas e aclimatizadas num fitotrão (câmara de aclimatação), em vasos contendo uma mistura 1:1 de terra de jardim e de areia, pelo menos 1,5 meses, antes de serem transferidas para condições de exterior, no Jardim Botânico ou no habitat natural.
 

Embriogénese somática

Segmentos de raiz, do primeiro par de folhas e pecíolos foram cultivados no mesmo meio base contendo 0,1; 0,5; 1 ou 2 mg/L de 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético). Após 2,5 meses de cultura ocorreu a formação de calo que foi repicado para o mesmo meio, onde após 1,5 meses se formaram embriões somáticos. Para a conversão de embriões em plântulas, os embriões isolados no estado cotiledonar, ou grupos de embriões somáticos com pequenas porções de calos associados, foram transferidos para o meio base MS ou ½ meio MS base, durante 1,5 meses.
Algumas porções de calos embriogénicos foram de novo subcultivadas em meios de indução com 1mg/L de 2,4-D, para manutenção da capacidade embriogénica.
Dado o elevado número de embriões somáticos formados por explante e a ausência de sincronismo durante o seu desenvolvimento, tornou-se difícil quantificar o número de embriões somáticos produzidos.
Com o objetivo de quantificar o potencial embriogénico dos explantes procedeu-se a uma contagem do número de plantas obtidas por unidade de calo (g de peso fresco), seguindo as diferentes etapas, que se apresentam na Figura 5.
Assim, amostras de calos produzidos em porções peciolares em meio com 1 mg/L 2,4-D foram pesados decorridos 2,5 meses de cultura. O peso das amostras de calo e a respetiva média foram determinados em mg com ulterior conversão para g, sendo os resultados apresentados em número de plantas por g de calo. Os calos permaneceram neste meio durante 1,5 meses, sendo de seguida subcultivados em meio base MS, de forma a permitir o desenvolvimento dos embriões somáticos e a formação de plântulas, parâmetro registado após 3 meses de cultura.

As plântulas produzidas foram por fim deixadas nos tubos de ensaio, para prosseguir o alongamento da raiz durante 8 a 15 dias, sendo depois lavadas e deixadas apenas com água destilada.
As plântulas com um comprimento de, pelo menos de 10 cm, foram retiradas dos tubos de ensaio, separadas e aclimatizadas num fitotrão, em vasos contendo uma mistura 1:1 de terra de jardim e de areia, durante, pelo menos 1,5 meses, antes de serem transferidas para condições de exterior, no Jardim Botânico e/ou habitat natural.

Estudo da variabilidade in vitro - citometria de fluxo

As plantas obtidas in vitro foram analisadas por citometria de fluxo para detetar eventuais alterações na quantidade de DNA. As análises foram feitas em folhas de plantas obtidas por embriogénese somática após indução com 2,4-D e em folhas de plantas obtidas por proliferação de meristemas, induzida por BA, bem como nos diferentes explantes (segmentos das folhas cotiledonares e ápices caulinares, respetivamente). Como controlo a análise foi feita em folhas de plântulas resultantes da germinação in vitro de sementes de plantas silvestres de dois anos diferentes.
A metodologia de citometria de fluxo foi descrita na secção 2.1.3.

Floração in vitro

Os segmentos nodais das plantas silvestres foram esterilizados conforme procedimentos descritos na secção 2.2.2. e inoculados em meio base MS, suplementado com sacarose a 3% e com dois PGRs: 1,5 mg/L BA e 0,5 mg/L IAA (ácido-3-indol acético), considerado o meio de indução.
Posteriormente foram realizadas subculturas utilizando a porção basal dos explantes, a cada 30 dias, para estudar o efeito combinado e isolado de BA e IAA, nas mesmas concentrações e condições de cultura. Nestas mesmas experiências avaliámos também a evolução da morfologia das inflorescências, que se agruparam em 4 estádios: 1-umbela fechada; 2- umbela com pétalas visíveis verdes, mas ainda fechadas; 3- pétalas visíveis brancas, mas ainda fechadas; 4- umbela com flores abertas e os estames expostos) (ver secção 3.2.1.6.1.).
Numa fase ulterior, combinações de BA e IAA foram testadas na indução floral. Num primeiro ensaio (experiência 1) as culturas de material vegetal proveniente do meio de indução foram subcultivadas no mesmo meio ou em meio base MS. Foram ainda testados o IAA e a BA isoladamente.
Num outro ensaio (experiência 2) avaliou-se o efeito isolado dos PGRs no processo da indução de floração. Assim, as culturas de material vegetal proveniente de meio MS foram repicadas para o mesmo meio e para meio com IAA; as amostras do meio BA foram repicadas para meio MS e meio IAA e as amostras do meio IAA para o mesmo meio e para meio com BA.
Em todos os ensaios, as concentrações de PGR, em conjunto ou isolados, foram as do meio de indução: 1,5 mg/L BA e 0,5 mg/L IAA. As culturas foram sempre analisadas ao fim de 4 semanas e os parâmetros usados para quantificar a resposta de indução floral foram o número de explantes com inflorescências e a percentagem dos quatro tipos morfológicos de inflorescências formados.
O mesmo processo de subcultura da porção basal dos explantes foi utilizado para o estudo do efeito na floração in vitro de outro PGR, o ácido giberélico (GA3), nas concentrações de 0,5, 1 e 2 mg/L e também de sacarose (6, 9 e 12%).
Num ensaio seguinte, as inflorescências em estados precoces de desenvolvimento foram transferidas para meio MS, de forma a tentar conseguir o seu desenvolvimento. Assim, após a indução in vitro da floração e o aparecimento dos primeiros botões florais, estes foram isolados e subcultivados em meio MS sem hormonas e mantidos até as flores completarem o desenvolvimento, fase em que se procedeu à observação e estudo da morfologia dos órgãos florais: flores, frutos, óvulos e anteras.

Estudos de pólen

Para caracterizar o pólen foram feitas observações após esmagamento das anteras em carmim acético e através de observação por microscopia de fluorescência usando o DAPI como fluorocromo. As observações de microscopia de fluorescência foram realizadas num microscópio.
Para avaliação do potencial germinativo dos grãos de pólen das flores formadas in vitro e das flores de plantas silvestres foram realizados ensaios de germinação, tendo sido previamente avaliada a viabilidade do pólen. Para tal, colheram-se flores de plantas formadas in vitro e de plantas silvestres, das quais se isolaram as anteras. As anteras foram deixadas durante cerca de 24 h à temperatura ambiente, em caixas de Petri forradas com papel de alumínio, para abrirem e libertarem o pólen, o qual foi depois colocado a germinar. Utilizou-se um meio de germinação base constituído por H3BO3 (5mg/L), CaClNO3 (15mg/L) e KNO3 (10mg/L) (Jahier et al., 1992), suplementado com sacarose. O pH foi ajustado a 5,8 e adicionou-se agar (0,8%). Foram preparados 7 meios distintos com 6 concentrações diferentes de sacarose (0, 3, 6, 9, 12 e 18 %). Depois de autoclavados, os meios foram distribuídos por caixas de Petri esterilizadas, numa câmara de fluxo laminar.
O pólen foi distribuído por 21 caixas de Petri, correspondentes aos 7 meios x 3 períodos de tempo, e decorridas 6, 12 e 24 h, foram retiradas aleatoriamente de cada caixa de Petri cinco amostras de material de dimensões semelhantes (0,25 cm2). As culturas foram periodicamente observadas à lupa para seguir a evolução do pólen.

Ensaios de polinização

Foram realizados testes de polinização manual in vitro e em umbelas de plantas silvestres.
Para isso, após a antese, as flores in vitro foram manipuladas em condições assépticas, numa câmara de fluxo laminar. Para a polinização artificial procedemos ao contato direto entre as flores no estádio 4, em que estavam abertas e com os estames expostos, e as flores no estádio 2, com pétalas enroladas e verdes. Pela análise anterior, realizada nas diferentes fases florais, observámos que no pólen proveniente de flores do estádio 2 se observavam os dois núcleos, germinativo e vegetativos (secção 3.2.1.6.4.). Estas foram previamente excisadas e mantidas numa caixa de Petri (9 cm de diâmetro) esterilizada.
Nas plantas silvestres os pistilos foram isolados de flores abertas e cultivados em caixas de Petri com agar a 1%. As anteras foram excisadas e mantidas numa caixa de Petri (9 cm de diâmetro) esterilizada e o pólen recolhido, após a antese das anteras; as flores abertas, foram sujeitas a polinização manual, em condições assépticas, numa câmara de fluxo laminar. A polinização foi concretizada em flores nas mesmas fases morfológicas adotadas para a polinização das flores produzidas in vitro.

Após a polinização manual e decorridos diferentes tempos - 0,5,1,2,4,8,15,20,24 h – os pistilos das flores produzidas in vitro e das flores silvestres, foram fixados em álcool a 70 % e deixados em conservação no frio até observação.

Para observação da germinação do tubo polínico os pistilos previamente fixados foram amolecidos numa solução 8N de hidróxido de sódio durante 1h. Após lavagem foram transferidos durante a noite para uma solução de azul de anilina 0,05% (p/v) preparada em 0,1 N de fosfato de potássio. Os pistilos foram de seguida colocados numa lâmina de microscópio com uma gota de glicerina, colocando-se uma lamela por cima e pressionando-se ligeiramente. As lâminas foram observadas num microscópio Nikon equipado com um sistema de epifluorescência, com filtro de excitação ultravioleta (transmissões de 330-380 nm) e um filtro de barreira de 420 nm, adotado da técnica utilizada por Martin (1971) em Lycopersicon chilense. As imagens foram captadas com uma máquina fotográfica Nikon Digital Sight DS-U1 e o software Act-2U.

Estudos histológicos e de SEM

Procedeu-se ao estudo da formação das flores in vitro em diferentes fases de cultura dos segmentos nodais. Para a realização de estudos histológicos, explantes cultivados em meio de indução floral durante 0, 4, 7, 11 e 15 dias foram fixados, durante 1,5 h, à temperatura ambiente, numa solução de glutaraldeído 2,5% (v/v) em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 6,8, contendo umas gotas de solução de cloreto de cálcio 0,01 M.
O material foi depois submetido a três lavagens de 15 min cada, no mesmo tampão, seguindo-se uma pós-fixação em tetróxido de ósmio 1% (p/w) preparado no mesmo tampão, durante 2 h, à temperatura ambiente.
Após 3 lavagens de 15 min em água destilada, as amostras foram desidratadas numa série crescente de etanol (70, 80, 90, 95 e 100 %; v/v) e de seguida impregnadas usando três misturas sucessivas de etanol 100 % e resina (Spurr, 1969), nas proporções 2:1, 1:1 e 1:2. As amostras permaneceram em cada mistura durante 2 horas e, por fim, em resina pura por uma noite. Após impregnação, os espécimes foram colocados em moldes de borracha com a resina, tendo permanecido numa estufa a 60ºC, durante 24 horas,de forma a polimerizar a resina. Nestes blocos foram realizados cortes semifinos (1-2 μm de espessura), utilizando um ultramicrótomo LKB Ultrotome III equipado com facas de vidro.
Os cortes foram transferidos para uma gota de água destilada sobre uma lâmina de vidro e deixados a secar durante cerca de 24 horas a 60ºC. Os cortes foram corados com uma solução de azul de toluidina (solução aquosa de azul toluidina 1 %, azur II 1 % e borato de sódio 1 % (Hall, 1978), durante 30 min, à temperatura ambiente e no escuro, tendo depois sido lavados duas vezes com água destilada e deixados a secar na estufa (60ºC), antes de se proceder à sua observação. As observações foram efetuadas num microscópio ótico Nikon Eclipse E400, e as imagens captadas com uma máquina fotográfica Nikon Digital Sight DS-U1 e usando o software Act-2U.

Amostras de flores formadas in vitro após 4 semanas de cultura no meio de indução (1,5 mg/L e 0,5mg/L IAA) foram também processadas para SEM. O procedimento adotado para a análise por SEM foi o mesmo que descrito anteriormente até à desidratação em etanol a 100 %. Em seguida as amostras foram secas a 40ºC num aparelho de secagem pelo método do ponto crítico num aparelho CPD 020 (Balzers), no qual o etanol é gradualmente substituído por CO2. De seguida foram depositadas em porta-amostras, metalizadas e observadas ao microscópio, como descrito em 2.1.2, tendo sido captadas as imagens com interesse.

Análise estatística

Para cada tratamento um mínimo de 8 e um máximo de 25 explantes foram utilizados e as experiências foram realizadas três vezes. Para a análise estatística, os dados quantitativos expressos em percentagem foram inicialmente submetidos a transformação arcosen e as médias sujeitas a uma nova conversão e erro padrão para percentagens (Zar, 1996). A análise estatística foi realizada por ANOVA (Statistica 7) e as médias significativamente diferentes foram identificadas pelo teste de Tukey (P = 0,05).

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