UTILIZACIÓN DE LA ESPECTROSCOPIA RAMAN PARA CARACTERIZACIÓN DE DISPLASIAS PROVENIENTES DEL CUELLO UTERINO

R. Ávila Rodríguez (CV)
raquel.avila@uaslp.mx
I. Compeán Martínez (CV)
Isaac.compean@uaslp.mx
M.B. Silva Cázares (CV)
macrina.silva@uaslp.mx
J. González Contreras (CV)
Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Resumen

Los diagnósticos clínicos de células provenientes del cuello uterino son muy importantes debido a que es la segunda causa de cáncer. En este estudio se evalúa el potencial de la espectroscopia Raman para la detección de displasia, la cual es un precursor del cáncer. Las muestras colectadas de células provenientes del cuello uterino fueron analizadas por patología y al mismo tiempo por espectroscopia Raman. Los métodos histológicos tradicionales requieren de reactivos y de una preparación especial de la muestra, en cambio, la espectroscopia Raman es una técnica óptica que no requiere de reactivos químicos y nos proporciona información de la composición bioquímica de la muestra, de tal forma que las bandas Raman obtenidas de una señal espectral puede indicarnos la presencia de proteínas, aminoácidos y lípidos.

Palabras clave: Cuello uterino, displasia, cáncer, histológicos, espectroscopia Raman.

Abstract

Clinical diagnosis from uterine cervix cells is so important, because it is the second most common malignancy. This study evaluates the potential of Raman spectroscopy for detection of dysplasia, a precursor to cervical cancer. In this work the samples from uterine cervix cells were analized by pathology and at the same time by Raman spectroscopy. Histological methods required chemical reagents and a special sample preparation, Raman spectroscopy is an optical technique that don´t need special chemical reagents, and provide information about biochemical molecular composition of the samples, so the Raman spectral obtained can contain multiples bands due to components such as proteins, amino acids, carbohydrates and lipids.

Keywords: Uterine cervix, dysplasia, cancer, histological methods, Raman Spectroscopy.

INTRODUCCIÓN
El Cáncer Cervicouterino (CaCu), constituye un importante problema de salud pública en especial en los países en desarrollo con un reporte anual de 510,000 casos [1]; su relevancia se encuentra envuelta en una triste paradoja: figura como una de las principales causas de muerte aunque es totalmente prevenible si se detecta oportunamente, el diagnóstico precoz es la intervención sanitaria mas eficiente y costo-efectiva, con una sobrevida a 5 años promedio de 91.5% de los casos de mujeres con cáncer [2].

En México en el 2005, se reportaron 495,240 defunciones, y de estas los tumores malignos ocupan el tercer lugar y el 13.3% corresponde al CaCu impactando directamente en la población femenina. Cada vez es más común ver mujeres jóvenes, de entre 20 y 30 años, que padecen esta enfermedad [3-4]. En el  estado de San Luís Potosí para el año 2005 se registró una tasa de mortalidad ajustada de 19.3, con 116 muertes [4], es decir, muere 1 mujer por CaCu cada tercer día.
La infección por el virus del papiloma humano (VPH) es posiblemente una de las infecciones más prevalentes en el mundo, se ha reportado que el VPH representa el 99.7% de los casos positivos de cáncer cervicouterino, y estudios nacionales han reportado que la presencia de VPH de alto riesgo aumenta 78 veces la probabilidad de presentar cáncer cervicouterino [5].

El Virus del Papiloma Humano (VPH) es  agente causal del CaCu, lo cual fue establecido desde hace más de 12 años [6]. Hasta el presente, se han reconocido más de 90 tipos de VPH, de los cuales, 35 afectan las mucosas. Estos pueden agruparse de acuerdo al riesgo oncogénico en tipos de: alto riesgo (AR) y bajo riesgo (BR). Estudios diferentes han demostrado que el VPH-AR está presente en más del 99.7% de los carcinomas invasores cervicales [7].

Existen más de 100 tipos de VPH, 30 de los cuales infectan el tracto ano genital femenino y masculino.  Los tipos de VPH se clasifican en grupos mucosos y cutáneos.  Los del grupo mucoso se clasifican a su vez en tres grupos, en base a su grado de asociación con neoplasia del cérvix uterino:

Después de la exposición a VPH, inicia una fase de incubación que dura 3 meses en promedio (rango 2 semanas a 18 meses), o bien el virus puede permanecer latente indefinidamente. Si se expresa la infección, ocurre una fase de proliferación activa que tarda de 3 a 6 meses, durante los cuales ocurre crecimiento anormal de la capa basal del epitelio escamoso cervical, replicación del ADN viral en las capas medias, ensamble viral, y efectos citopáticos en las capas superficiales.  Esto se puede manifestar de diversas formas: como áreas de displasia, como presencia de DNA viral, y/o como papilomas y condilomas.  La mayoría de infecciones virales son transitorias, de tal manera que cerca del 50% se resuelven a los 8 meses a 24 meses, y cerca del 20% persisten o recurren.

Como resultado de este proceso, la unión escamocolumnar de la zona de transformación del epitelio cervical sufre alteraciones citopáticas, tales como: koilocitosis, crecimiento nuclear, diskeratosis, multinucleación, y NIC.  Estas lesiones pueden persistir, involucionar, o progresar a cáncer invasor.

Varios estudios, demuestran que la infección por VPH-AO es un factor etiológico necesario, aunque no suficiente, de cáncer cervical [10-12]. Actualmente se acepta que el VPH se encuentra en prácticamente todos los casos de cáncer cervical.

El origen del cáncer a nivel de tejido uterino es una enfermedad que se inicia en el epitelio y en un período evolutivo de 10 años se denomina fase preclínica  o neoplasia intraepitelian cervical (NIC). Si esta etapa no es alterada en su evolución, pasa a lo que se denomina el cáncer invasivo que es más común en  el epitelio escamoso entre el 85 y 95% y en el epitelio columnar de un 5 al 14 % [13]. Los virus oncogénicos, abren la doble hélice del genoma  en los puentes disulfuro  e intercambian el contenido del ADN con la célula basal del epitelio escamoso, el  resultado es una célula con un contenido aneuploide de cromosomas es lo que se denomina una célula neoplásica, es decir células inmaduras, con gran capacidad  proliferativa y que en cualquier momento, dependiendo de la agresividad del clon celular y de   la respuesta inmune del huésped, puede localizarse, revertir  espontáneamente   por mecanismos inmunológicos o producir       ruptura de la membrana basal generando el cáncer invasivo [14].

En los últimos años se      ha presentado un notable incremento en el diseño e  implementación de técnicas para la medición de bioseñales, las cuales han permitido el estudio del comportamiento          o evolución de patologías en algunos órganos del cuerpo humano.

Son diversos los métodos de diagnóstico de precánceres de cuello uterino utilizados a través del tiempo y ellos han estado ligados a los avances que se han tenido sobre el conocimiento de la fisiopatología, en la carcinogénesis del cuello  uterino.

CITOLOGÍA. “La citología vaginal fue introducida por Papanicolaou desde 1928, su  contribución fue honrada dándole el nombre de        PAP, al nuevo método para el diagnóstico del cáncer de cervical. Otros autores como el patólogo  Rumano Babes y el ginecólogo Italiano Viana, sugirieron el uso de la citología vaginal antes que el mismo Papanicolaou, la comunidad científica no dió crédito  por lo que los autores suspendieron los estudios, los que se reiniciaron  en 1939 mediante los extendidos vaginales realizados con  el ginecólogo Herbert Traut, en  1943 publicaron sus hallazgos y conclusiones en la famosa monografía titulada  diagnóstico del cáncer uterino          por extendido vaginal. La aplicación de este  método masivamente a la población ha disminuido en un 80% la mortalidad, sin embargo en nuestro medio  las bajas coberturas y las condiciones de pobreza de la población explican la alta mortalidad por esta patología” [15].

Actualmente se usa el sistema Bethesda para el diagnóstico citológico, que hace  énfasis en la descripción morfológica y clasifica las lesiones escamosas en LEI de bajo grado  (LEI - BG), que comprende las lesiones por VPH y NIC I y LEI de alto grado (LEI - AG), que abarca NIC II y NIC III
 
COLPOSCOPIA.    “La colposcopia       fue introducida en 1925 por el    profesor  Hinnselman, origen Alemán, esta es la parte clínica en el análisis de las alteraciones epiteliales e invasivas        del cuello uterino. El colposcopio           es un  microscopio de bajo poder, al cual se le ha adicionado un filtro verde, para el  análisis de los vasos del cuello uterino; este procedimiento estima las alteraciones  de los           vasos           terminales del cuello, donde se reflejan desde una etapa muy  temprana los cambios en los tejidos de la neoplasia y valora la extensión clínica de la lesión en el cuello uterino, facilitando la toma de biopsia del sitio más patológico con el fin de  planear el tratamiento de una manera individualizada” [15].

 HISTOLOGÍA. “La histología se ha utilizado como el diagnóstico definitivo de las  lesiones cervicales y es indispensable para realizar el tratamiento y seguimiento de las pacientes; ésta consiste en el análisis microscópico de una porción de tejido  que ha sido extraída bajo el examen colposcópico, en este tejido se observa el epitelio y estroma, donde se ubican las diferentes alteraciones que servirán para el  diagnóstico de las alteraciones patológicas. Las lesiones intraepiteliales NIC se encuentran sólo en el epitelio y en un período de 10 a 15 años evolucionan en cáncer invasivo, donde ya hay compromiso del estroma” [15]. 

La utilización de sondas moleculares de ADN y la reacción en cadena de polimerasa (PCR) en muestras de frotis cervical e hísticas constituyen los métodos de elección para confirmar el diagnóstico y clasificar la infección. En los últimos años se han venido desarrollando técnicas alternativas para la medición de muestras biológicas, como la caracterización de tumores [16], la caracterización de bacterias y anticuerpos en soluciones acuosas por medio de espectroscopías ópticas [17-18]. Una de las técnicas de espectroscopía que ha demostrado tener potencial para aplicaciones del área biomédica, es la espectroscopía Raman [19], ya que es posible realizar mediciones sobre muestras sólidas, líquidas o gaseosas, sin que estas requieran de reactivos químicos o de alguna preparación especial [20-21]. Los espectros Raman de muestras biológicas exhiben bandas bien definidas correspondientes a los modos de vibración molecular, por lo que es posible realizar el análisis de mezclas ya que cada especie molecular en la mezcla, exhibe un espectro Raman característico.
La espectroscopía Raman es una técnica fotónica de alta resolución que se basa en hacer incidir un haz de luz monocromático sobre la muestra a analizar, una pequeña fracción de esta luz es dispersada inelásticamente experimentando cambios en frecuencia, estos cambios son los que nos proporcionan información química y estructural de la muestra analizada. Es importante mencionar que la magnitud del  desplazamiento Raman es independiente de la longitud de onda de excitación. Una ventaja importante de la espectroscopia Raman es el hecho de que el agua no produce interferencias y, por tanto es posible obtener espectros Raman de fluidos biológicos [22].

OBJETIVO
Utilizar la espectroscopia Raman como una herramienta para la caracterización de los cambios bioquímicos relacionados con la aparición de displasias en células provenientes del cuello uterino.
METODOLOGIA
Las muestras de tejido cervicouterino fueron colectadas de 10 pacientes que acuden a la prueba de Papanicolaou del centro de salud de Ahualulco, N° 100 de la jurisdicción N° 111 perteneciente a Soledad de Graciano Sánchez, San Luís Potosí. Las muestras se procesaron en el laboratorio de patología del Hospital Central “Dr. Ignacio Morones Prieto” de S.L.P. Se colectaron muestras dobles por paciente, una para el análisis de patología y la otra para la medición con espectroscopia Raman, de las cuales los resultaros de Patología arrojaron 8 como  sanas y dos con un grado leve de displasia, las mismas muestras se midieron con  raman tomando 3 espectros por muestra, para asegurarse de la repetitividad de la medición.
Los espectros resultantes fueron procesados aplicando la línea base, quitando ruido, y obteniendo un espectro promedio de los espectros con displasia y los sanos. Se utilizó el software Origin versión 8.0 y  Mathlab 9.0 para el procesamiento de las señales espectrales.
El equipo  de espectroscopia Raman consiste en una fuente de Luz de radiación láser de 785nm a 300mW que es la que excita a la muestra, la luz dispersada por la muestra es colectada por un espectrómetro, donde las frecuencias Raman son detectadas por una cámara CCD de 256x1024 pixeles, la cual convierte las señales luminosas en señales eléctricas, para ser procesadas y finalmente observadas en una computadora, como se muestra en la fotografía de la figura 1.

Figura 1. Sistema utilizado en la medición con espectroscopía Raman
RESULTADOS
Los resultados de las mediciones fueron analizados por una comparación visual de los espectros Raman de las muestras sanas y con displasia, con la idea de encontrar diferencias espectrales tales como desplazamientos Raman diferentes, o bien cambios en intensidad, los cuales pueden estar correlacionados con la presencia o ausencia de displasias.
La figura 2 muestra  el espectro Raman promedio de las muestras sanas y las muestras con displasia, en la cual podemos observar que existe diferencia en la intensidad Raman, ya que no existen bandas Raman adicionales que se observen en la comparación de los espectros, en la banda centradas en la región 1144cm-1 el espectro de la muestra con displasia es  más grande que la muestra sana, estos resultados sugieren que la información contenida en el espectro está relacionada con los cambios de intensidad debido al incremento de células.
Los resultados de citología cervical muestran una relación con los espectros resultantes, ya que los espectros con displasia corresponden a los resultados que arroja el laboratorio de patología indicando cambios en el crecimiento celular.

Figura 2. Cambios en Intensidad Raman debido a cambios en concentración de células.
En la figura 3 se muestra el espectro promedio de las muestras con displasia, donde la frecuencia de 1144cm-1 está relacionada con el modo vibracional C-O, y la de 1322cm-1 con lípidos y proteínas [20].

Figura 3. Espectro Raman promedio de las muestras con displasia.
En la tabla 1 se muestran los grupos funcionales asociados a las frecuencias Raman encontradas.  
Tabla 1. Asignaciones de los grupos funcionales a las frecuencias Raman.

CONCLUSIONES
Los espectros Raman analizados del cuello uterino nos proveen información de los cambios bioquímicos, en donde  la intensidad Raman de los espectros está relacionada con el crecimiento celular  y  las regiones espectrales obtenidas se pueden asociar con la presencia de C-O, proteínas, OH, NH, lípidos y ácidos nucleicos; según lo reportado en la literatura [19], en este estudio, la técnica de espectroscopia Raman nos permitió identificar la  presencia de displasias en concordancia con  los resultados obtenidos de la citología cervical reportados por el laboratorio de  patología.

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